Изоферменты. Строение, биологическая роль, диагностическое значение определения, изменение в онтогенезе и при патологии органа, диагностическое значение. Структурно-функциональная организация ферментов. Регуляция активности ферментов. Определение амилазно

23.09.2019

ИЗОФЕРМЕНТЫ (син.: множественные формы ферментов, изозимы ) - молекулярные формы (разновидности) определенного фермента, отличающиеся только по физико-химическим свойствам; определение изофермент-ного спектра различных ферментов в сыворотке крови является одним из важных методов клин, энзимодиагностики. И. обнаружены в тканях человека, животных, растений и микроорганизмов. Известно св. 50 ферментов, представленных в виде И. в различных органах и тканях человека, животных и растений.

И. могут отличаться друг от друга по четвертичной структуре, т. е. по характеру и количеству субъединиц, входящих в состав их молекул, по электрофоретической подвижности, адсорбционным свойствам, сродству к субстрату, оптимальному значению pH, субклеточной локализации, специфичности в отношении коферментов (см.) и т. д. Так, напр., большинство органов и тканей человека и животных содержит пять И. лактатдегидрогеназы (ЛДГ), каждый из которых представляет собой различные комбинации из четырех субъединиц двух типов с мол. весом 34 500, условно обозначенных «Н» и «М» (см. Лактатдегидрогеназа). Оба типа субъединиц различаются по аминокислотному составу, последовательности остатков аминокислот в молекуле, иммунохим. и электрофоретическим свойствам. Синтез субъединиц контролируется двумя различными генами. Малатдегидрогеназа (МДГ) представлена в различных тканях человека и животных двумя И., один из которых локализован в митохондриях, а другой - в цитоплазме. Оба эти И. различаются по специфичности в отношении НАД и чувствительности к ингибиторам (напр., оксалату). И. изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ; КФ 1.1.1. 41 и 1.1.1.42) различаются по специфичности к коферментам (НАД и НАДФ), а также по субклеточной локализации: НАД-ИЦДГ локализована в митохондриях, а НАДФ-ИЦДГ и в митохондриях, и в цитоплазме. Митохондриальная и цитоплазматическая НАДФ-ИЦДГ различаются между собой по каталитическим, электрофоретическим и иммунохим. свойствам.

Для идентификации и разделения И. используют различные физ.-хим. методы исследования: различные виды электрофореза (см.), адсорбционную и ионообменную хроматографию (см.), гель-фильтрацию (см.) и др. Наиболее широкое распространение как самый доступный получил метод электрофореза в полиакриламидном геле (диск-электрофорез). Различия в электрофоретических свойствах являются основой для классификации многих И. Для обозначения И. приводится сокращенное название фермента с соответствующим подстрочным порядковым номером, который характеризует электрофоретическую подвижность И. при определенном значении pH. Напр., И. лактатдегидрогеназы обозначаются как ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3 и т. д.

Биол, значение наличия множественных форм ферментов еще не ясно. Предполагают, что И. играют определенную роль в регуляции метаболических процессов в клетке. Возможно, что И. обеспечивают приспособляемость организма к изменениям окружающей среды и обусловливают специфичность обмена, характерную именно для данной ткани. Поэтому многие ферменты, занимающие ключевые позиции в обмене веществ, имеют И. (ЛДГ, МДГ, ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование, различные аминотрансферазы). Возможно, что различные И. одного и того же фермента специфически катализируют прямую или обратную реакции определенной ферментативной реакции (см. Лактатдегидрогеназа). О важной роли И. в тонкой регуляции метаболических процессов свидетельствует изменение их спектра под влиянием ряда воздействий и физиол, факторов (денервации, различных гормонов, охлаждения, гипоксии и др.). Отмечено изменение в характере распределения различных И. в тканях человека и животных в эмбриогенезе. Однако для изученных ферментов пока не найдено специфических эмбриональных форм И.

Спектр И. в количественном и качественном отношении в различных тканях человека и животных различен и часто строго специфичен. Это имеет большое диагностическое значение. Поскольку биосинтез отдельных И. и их субъединиц контролируется различными генами, предполагают, что видоизменение гена влечет за собой появление атипичных И. в тканях и крови. Т. о., возникает возможность использования определения спектров И. для диагностики генетических аномалий. Ряд патол. процессов, особенно дегенеративно-деструктивного характера, связан с изменением проницаемости клеточных мембран, что является причиной изменения спектра И. в сыворотке крови больного. Поэтому определение И. в крови и тканях человека находит все более широкое применение в клинике. Для решения некоторых вопросов диагностики, патогенеза и терапии ряда заболеваний определение изоферментных спектров имеет существенное преимущество по сравнению с определением общей активности того или иного фермента. Наибольшее диагностическое значение имеет определение изофермент-ного спектра ЛДГ, который меняется при инфаркте миокарда (резко повышается активность ЛДГ1 и ЛДГ2). Изменения спектра И. ЛДГ в сыворотке крови сохраняются дольше, чем изменения суммарной активности фермента, и могут обнаруживаться тогда, когда общая активность ЛДГ возвращается к норме. Отклонения спектра И. ЛДГ от нормы отмечены при заболеваниях гепатобилиарной системы, при мышечных дистрофиях, опухолевых заболеваниях, остром лейкозе, патол, процессах в легких (острые очаговые и крупозная пневмонии, обострение хрон, пневмонии и др.)*

Диагностическим тестом служат также изменения спектров И. и других ферментов, напр, значительное увеличение катодных фракций МДГ (в особенности митохондриальной фракции) в сыворотке крови больных циррозом печени но сравнению с сывороткой крови больных хрон, гепатитом. Определение спектра И. и общей активности МДГ в крови находит широкое применение для диагностики и оценки тяжести асфиксии у новорожденных. Изменения активности И. кислой фосфатазы отмечаются при болезни Гоше (см. Гоше болезнь), раке предстательной железы и множественной миеломе. Для диагностики ряда заболеваний печени используют определение спектра И. щелочной фосфатазы (см. Фосфатазы).

Определение И. аминотрансфераз (см.) также имеет диагностическую ценность. В печени, почках, сердечной мышце человека обнаруживаются два И. аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1; АсАТ). Один из них локализуется в митохондриях, другой - в цитоплазме клеток. Ок. 79% всей активности АсАТ приходится на долю митохондриального И. и лишь 21% на долю цитоплазматического. При тяжелом течении болезни Боткина в сыворотке крови обнаруживается два И. АсАТ, тогда как в норме и при легком течении заболевания - только один.

При повреждениях скелетной мускулатуры, а также при инфаркте миокарда в сыворотке крови повышается активность креатинкиназы (см.), а также изменяется спектр ее И.

Библиография: Генетика изоферментов, под ред. Д. К. Беляева, М., 1977, библиогр.; Иванов И. И., Коровки н Б. Ф. и М а р к e л о в И. М. Введение в клиническую энзимологии), Л., 1974, библиогр.; Комаров Ф. И., Коровкин Б. Ф. и Меньшиков В. В. Биохимические исследования в клинике, Л., 1976; Ленинджср А. Биохимия, пер. с англ., с. 217 и др., М., 1976; Проблемы медицинской химии, под ред. В. С. Шапота и Э. Г. Ларского, с. 5, М., 1973; У и л к и н с о н Д. Изоферменты, пер. с англ., М., 1968; Успехи биологической химии, под ред. В. Л. Кретовича и др., т. 9, с. 55, М., 1972; Enzyme nomenclature, Amsterdam, 1965; К а р 1 a n N. О. Symposium on multiple forms of enzymes and control mechanisms, Bact. Rev., "v. 27, p. 155, 1963; Latner A. L. Isoenzymes, Advanc. clin. Chem., v. 9, p. 69, 1967.

Л. В. Павлихина.

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изофермен-тами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.

Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

10. Органная специфичность изоферментов ЛДГ. Физиологические значения общей активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности ЛДГ и ее изоферментов.

Лактатдегидрогеназа является гликолитическим ферментом и катализирует следующую реакцию: Лактат + НАД Лактатдегидрогеназа Пируват + НАДН

Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из одного или двух типов субъединиц, обозначаемых как M (мышцы) и H (сердце). В сыворотке крови фермент существует в пяти молекулярных формах, различающихся по первичной структуре, кинетическим свойствам, электрофоретической подвижности (ЛДГ‑1 быстрее движется к аноду по сравнению с ЛДГ‑5, то есть более электрофоретичеки подвижна). Каждая форма имеет характерный полипептидный состав: ЛДГ‑1 состоит из 4 H‑субъединиц, ЛДГ‑2 - из 3 H‑субъединиц и 1 M‑субъединицы, ЛДГ‑3 представляет собой тетрамер из 2 H‑субъединиц и 2 M‑субъединиц, ЛДГ‑4 содержит 1 H‑субъединицу и 3 M‑субъединицы, ЛДГ‑5 состоит только из M‑субъединиц. По степени убывания общей каталитической активности энзима все органы и ткани располагаются в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови.

От того, какой изофермент наиболее представлен, зависит преимущественный способ окисления глюкозы в ткани: аэробный (до CO2 и H2O) или анаэробный (до молочной кислоты). Подобное различие обусловлено разной степенью сродства изоферментов к пировиноградной кислоте. Изоферменты, содержащие в основном H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2), обладают низким сродством к пирувату и поэтому неспособны эффективно конкурировать за субстрат с пируватдегидрогеназным комплексом. В результате пируват подвергается окислительному декарбоксилированию и в виде ацетил‑КоA вступает в цикл Кребса.

Напротив, изоферменты, обладающие главным образом M‑субъединицами (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5), имеют более высокое сродство к пирувату и, как следствие, превращают его в молочную кислоту. Для каждой ткани установлены наиболее типичные изоферменты. Для миокарда и мозговой ткани основным изоэнзимом является ЛДГ‑1, для эритроцитов, тромбоцитов, почечной ткани - ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2. В легких, селезенке, щитовидной и поджелудочной железах, надпочечниках, лимфоцитах преобладает ЛДГ‑3. ЛДГ‑4 находится во всех тканях с ЛДГ‑3, а также в гранулоцитах и мужских половых клетках, в последних дополнительно обнаруживается ЛДГ‑5. В скелетных мышцах изоферментная активность располагается в порядке убывания в ряду: ЛДГ‑5, ЛДГ‑4, ЛДГ‑3. Для печени наиболее характерен изофермент ЛДГ‑5, выявляется также ЛДГ‑4.

В норме основным источником активности ЛДГ в плазме крови являются разрушающиеся клетки крови. В сыворотке активность изоферментов распределяется следующим образом: ЛДГ‑2 > ЛДГ‑1 > ЛДГ‑3 > ЛДГ‑4 > ЛДГ‑5. При электрофорезе между фракциями ЛДГ‑3 и ЛДГ‑4 иногда обнаруживается дополнительная полоса изофермента ЛДГ‑X, данный изофермент локализован в тех же органах, что и ЛДГ‑5.

Все заболевания, протекающие с разрушением клеток, сопровождаются резким повышением активности ЛДГ в сыворотке крови. Нарастание общей активности фермента обнаруживается при таких заболеваниях как инфаркт миокарда, некротическое поражение почек, гепатит, панкреатит, воспаление и инфаркт легкого, опухоли различной локализации, повреждения, дистрофия и атрофия мышц, гемолитические анемии и физиологическая желтуха новорожденных, лимфогранулематоз, лейкозы. При инфаркте миокарда начало роста активности фермента в сыворотке крови отмечается на 8‑10 час от момента приступа, максимальное увеличение наступает к 24‑48 часу, нередко в 15‑20 раз превышая норму. Повышенная активность ЛДГ сохраняется до 10‑12 суток от начала заболевания. Степень нарастания активности фермента не всегда коррелирует с размерами поражения сердечной мышцы и для прогноза исхода заболевания может являться лишь ориентировочным фактором. У больных стенокардией активность фермента не изменяется, что позволяет применять тест для дифференциальной диагностики в пределах 2‑3 суток после сердечного приступа. Наличие органной специфичности ферментов позволяет применять исследование их активности с целью топической диагностики.

11. Физиологические значения общей активности креатининкиназы (КК) и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности КК и ее изоферментов.

Креатинкиназа (КК) – это фермент, природный катализатор химических реакций, значительно увеличивающий скорость преобразования креатина и АТФ (аденозинтрифосфат) в высокоэнергетическое соединение креатинфосфат, который расходуется при интенсивных мышечных сокращениях. Данный фермент содержится в цитоплазме клеток различных мышц (сердечной, скелетных), а также в клетках мозга, легких, щитовидной железы.

Молекулу креатинкиназы можно поделить на две части, каждая из которых реализуется в виде отдельной субъединицы: М (мышца), и B (мозг). Данные субъединицы в организме человека могут объединяться вместе тремя способами, образуя, соответственно, три изоформы креатинкиназы: ММ, МВ и ВВ. Эти изоферменты отличаются своей локализацией в организме человека: креатинкиназа ММ расположена в миокарде и скелетных мышцах; креатинкиназа МВ локализована в большей степени в миокарде; креатинкиназа ВВ содержится в клетках плаценты, головного мозга, мочевыводящих путей, некоторых опухолях и других местах.

Нормальная концентрация фермента напрямую зависит от возраста и пола человека. В связи с активным развитием мускулатуры и нервной системы, у детей активность природного катализатора повышена по отношению к активности у взрослых. У женщин креатинкиназа ниже, чем у мужчин.

Уровень изофермента ММ оказывается повышен в большей степени в результате повреждений мышц, и редко при повреждениях сердца. Содержание КК МВ связано с повреждением миокарда. Значительное увеличение активности данной формы наблюдается при инфаркте миокарда. Ее уровень резко возрастает уже через два - четыре часа после первых симптомов. Поэтому концентрация данного фермента в крови активно используется для определения инфаркта миокарда. Однако, стоит отметить, что содержание КК МВ возвращается к нормальному уровню по прошествии трех-шести дней, что обуславливает низкую эффективность диагностики на поздних сроках. Концентрация КК ВВ увеличивается при онкологических заболеваниях. Снижение уровня изоферментов не несет никакой диагностической ценности, так как минимальный порог содержания КК у здорового человека равен нулю.

12. Липазы плазмы крови. Диагностическая значимость определения активности липазы. Липаза - синтезируемый человеческим организмом водорастворимый фермент, катализирующий гидролиз нерастворимых эстеров (липидных субстратов) и способствующий перевариванию, растворению и фракционированию нейтральных жиров. Вместе с желчью липаза стимулирует переваривание жиров, жирных кислот, жирорастворимых витаминов А, Е, D, К, трансформируя их в энергию и тепло. Назначением липопротеинлипазы является расщепление триглицеридов (липидов) в липопротеинах крови, благодаря чему обеспечивается доставка жирных кислот к тканям. Липазу вырабатывают: поджелудочная железа; печень; легкие; кишечник особые железы, расположенные в ротовой полости детей грудного возраста. В последнем случае синтезируется так называемая лингвальная липаза. Каждый из перечисленных ферментов способствует расщеплению определенной группы жиров.

С точки зрения значимости при постановке диагноза важную роль играет липаза, вырабатываемая поджелудочной железой. Повышение уровня фермента отмечается при: панкреатите, протекающем в острой форме, или при обострении хронического процесса; желчных коликах; травме поджелудочной железы; наличии в поджелудочной железе новообразований; хронических патологиях желчного пузыря; образовании кисты или псевдокисты в поджелудочной железе; закупорке панкреатического протока рубцом или камнем; внутрипеченочном холестазе; острой кишечной непроходимости; инфаркте кишечника; перитоните; прободении язвы желудка; перфорации внутреннего (полого) органа; острой или хронической почечной патологии; эпидемическом паротите, при котором происходит поражение поджелудочной железы; нарушениях обменных процессов, имеющих место при сахарном диабете, ожирении или подагре; циррозе печени; длительном приеме медицинских препаратов – в частности, барбитуратов, анальгетиков наркотического ряда, гепарина, индометацина; операции по трансплантации органов. В редких случаях процесс активизации липазы оказывается связанным с некоторыми травмами – например, переломами трубчатых костей. Но в этом случае колебания уровня фермента в крови не могут считаться специфическим показателем наличия физического повреждения. По этой причине анализы на липазу не учитываются при диагностике травм различного происхождения.

Определение уровня липазы в сыворотке обретает особую важность при любом поражении поджелудочной железы. В этом случае анализ крови на содержание данного энзима вместе с анализом на амилазу (фермент, способствующий расщеплению крахмала до олигосахаридов) с высокой степенью достоверности указывает на наличие патологического процесса в тканях поджелудочной железы: оба показателя оказываются выше нормы). В процессе нормализации состояния больного названные ферменты возвращаются к адекватным показателям не одновременно: как правило, уровень липазы остается на высоком уровне дольше, чем уровень амилазы.

Высокий уровень липазы сохраняется от 3 до 7 суток с начала развития воспаления. Тенденция к снижению фиксируется только спустя 7-14 дней.

Низкий уровень липазы фиксируется: при наличии злокачественного новообразования в любой части организма, кроме самой поджелудочной железы; вследствие снижения функции поджелудочной железы; при кистозном фиброзе (муковисцидозе) – генетическом заболевании с тяжелым течением, возникающем в результате патологического поражения желез внешней секреции (ЖКТ, легких). после оперативного вмешательства по удалению поджелудочной железы; при избыточном содержании триглицеридов в крови, возникающем по причине неправильного питания с обилием жирных продуктов в рационе или вследствие наследственной гиперлипидемии. В некоторых случаях снижение уровня липазы является маркером перехода панкреатита в хроническую форму.

Давно выяснено, что все ферменты являются белками и обладают всеми свойствами белков. Поэтому подобно белкам ферменты делятся на простые и сложные.

Простые ферменты состоят только из аминокислот – например, пепсин , трипсин , лизоцим .

Сложные ферменты (холоферменты ) имеют в своем составе белковую часть, состоящую из аминокислот – апофермент , и небелковую часть – кофактор . Примером сложных ферментов являются сукцинатдегидрогеназа (содержит ФАД), аминотрансферазы (содержат пиридоксальфосфат), пероксидаза (содержит гем), лактатдегидрогеназа (содержит Zn 2+), амилаза (содержит Ca2+ ).

Кофактор , в свою очередь, может называться коферментом (НАД+ , НАДФ+ , ФМН, ФАД, биотин) или простетической группой (гем, олигосахариды, ионы металлов Fe2+ , Mg2+ , Ca2+ , Zn2+ ).

Деление на коферменты и простетические группы не всегда однозначно:
если связь кофактора с белком прочная, то в этом случае говорят о наличии простетической группы ,
но если в качестве кофактора выступает производное витамина - то его называют коферментом , независимо от прочности связи.

Для осуществления катализа необходим полноценный комплекс апобелка и кофактора, по отдельности катализ они осуществить не могут. Кофактор входит в состав активного центра, участвует в связывании субстрата или в его превращении.

Как многие белки, ферменты могут быть мономерами , т.е. состоять из одной субъединицы, и полимерами , состоящими из нескольких субъединиц.

Структурно-функциональная организация ферментов

В составе фермента выделяют области, выполняющие различную функцию:

1. Активный центр – комбинация аминокислотных остатков (обычно 12-16), обеспечивающая непосредственное связывание с молекулой субстрата и осуществляющая катализ. Аминокислотные радикалы в активном центре могут находиться в любом сочетании, при этом рядом располагаются аминокислоты, значительно удаленные друг от друга в линейной цепи. В активном центре выделяют два участка:

якорный (контактный, связывающий) – отвечает за связывание и ориентацию субстрата в активном центре,
каталитический – непосредственно отвечает за осуществление реакции.

Схема строения ферментов

У ферментов, имеющих в своем составе несколько мономеров, может быть несколько активных центров по числу субъединиц. Также две и более субъединицы могут формировать один активный центр.

У сложных ферментов в активном центре обязательно расположены функциональные группы кофактора.

Схема формирования сложного фермента

2. Аллостерический центр (allos – чужой) – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы (называемой активатором или ингибитором, а также эффектором, модулятором, регулятором) вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты являются полимерными белками, активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.

Схема строения аллостерического фермента

В качестве такого регулятора может выступать продукт данной или одной из последующих реакций, субстрат реакции или иное вещество (см "Регуляция активности ферментов ").

Изоферменты

Изоферменты – это молекулярные формы одного и того же фермента, возникшие в результате небольших генетических различий в первичной структуре фермента, но катализирующие одну и ту же реакцию . Изоферменты отличаются сродством к субстрату, максимальной скоростью катализируемой реакции, чувствительностью к ингибиторам и активаторам, условиями работы (оптимум pH и температуры).

Как правило, изоферменты имеют четвертичную структуру, т.е. состоят из двух или более субъединиц. Например, димерный фермент креатинкиназа (КК) представлен тремя изоферментными формами, составленными из двух типов субъединиц: M (англ. muscle – мышца) и B (англ. brain – мозг). Креатинкиназа-1 (КК-1) состоит из субъединиц типа B и локализуется в головном мозге, креатинкиназа-2 (КК-2) – по одной М- и В-субъединице, активна в миокарде, креатинкиназа-3 (КК-3) содержит две М-субъединицы, специфична для скелетной мышцы.

Также существует пять изоферментов лактатдегидрогеназы (роль ЛДГ) – фермента, участвующего в обмене глюкозы. Отличия между ними заключаются в разном соотношении субъединиц Н (англ. heart – сердце) и М (англ. muscle – мышца). Лактатдегидрогеназы типов 1 (Н 4) и 2 (H 3 M 1) присутствуют в тканях с аэробным обменом (миокард, мозг, корковый слой почек), обладают высоким сродством к молочной кислоте (лактату) и превращают его в пируват. ЛДГ-4 (H 1 M 3) и ЛДГ-5 (М 4) находятся в тканях, склонных к анаэробному обмену (печень, скелетные мышцы, кожа, мозговой слой почек), обладают низким сродством к лактату и катализируют превращение пирувата в лактат. В тканях с промежуточным типом обмена (селезенка, поджелудочная железа, надпочечники, лимфатические узлы) преобладает ЛДГ-3 (H 2 M 2).

Еще одним примером изоферментов является группа гексокиназ , которые присоединяют фосфатную группу к моносахаридам гексозам и вовлекают их в реакции клеточного метаболизма. Из четырех изоферментов выделяется гексокиназа IV (глюкокиназа ), которая отличается от остальных изоферментов высокой специфичностью к глюкозе, низким сродством к ней и нечувствительностью к ингибированию продуктом реакции.

Мультиферментные комплексы

В мультиферментном комплексе несколько ферментов прочно связаны между собой в единый комплекс и осуществляют ряд последовательных реакций, в которых продукт реакции непосредственно передается на следующий фермент и является только его субстратом. Возникает туннельный эффект , т.е. субстрат попадает в созданный ферментами "туннель". В результате промежуточные метаболиты избегают контакта с окружающей средой, снижается время их перехода к следующему активному центру и значительно ускоряется скорость реакции.

) и катализирующие конкретные реакции. Такая способность возникает в результате формирования промежуточного продукта при связывании антитела с антигеном (имитация переходного комплекса E-X ферментативной реакции).

Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

Изоформы лактатдегидрогеназы. Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты) (см. раздел 7).

Лактатдегидрогеназа - олигомерный белок с молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4 субъединиц 2 типов: М (от англ, muscle - мышца) и Н (от англ, heart - сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2-35, А). ЛДГ 1 и ЛДГ 2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются различные формы этого фермента.

Изоформы ЛДГ отличаются электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ (рис. 2-35, Б).

Изоформы креатинкиназы. Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата:

Молекула КК - димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ, muscle - мышца) и В (от англ, brain - мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента - ВВ, MB, MM. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ - в скелетных мышцах и MB - в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность (рис. 2-36).

Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

Изоферменты - это ферменты, синтез которых кодируется разными генами, у них разная первичная структура и разные свойства, но они катализируют одну и ту же реакцию. Виды изоферментов:

Органные - ферменты гликолиза в печени и мышцах.

Клеточные - малатдегидрогеназа цитоплазматическая и митохондриальная (ферменты разные, но катализируют одну и ту же реакцию).

Гибридные - ферменты с четвертичной структурой, образуются в результате нековалентного связывания отдельных субъединиц (лактатдегидрогеназа - 4 субъединицы 2 типов).

Мутантные - образуются в результате единичной мутации гена.

Аллоферменты - кодируются разными аллелями одного и того же гена.

10. I. Применение ферментов с лечебной целью в свою очередь подразделяется на два вида: 1) применение в целях заместительной терапии и 2) с целью воздействия фермента на очаг заболевания.

С целью заместительной терапии наиболее широко используют пищеварительные ферменты, когда у пациента обнаруживается их недостаточность. В качестве примера можно привести препараты желудочного сока или чистыйпепсин или ацидин-пепсин, который незаменим при гастритах с секреторной недостаточностью, при диспепсиях у детей. Панкреатин - препарат, представляющий смесь ферментов поджелудочной железы, применяют при панкреатитах, в основном хронического характера. Такое же значение имеют известные препараты холензим, панзинорм и др.

Другая область применения заместительной терапии - это лечение заболеваний, связанных с так называемымиэнзимопатиями . Это заболевания врожденные или наследственные, при которых нарушен синтез каких-либо ферментов. Эти заболевания обычно чрезвычайно тяжелые, дети с наследственным отсутствием какого-либо фермента живут недолго, страдают тяжелыми умственными и расстройствами, отсталостью физического и умственного развития. Заместительная терапия иногда может помочь преодолеть эти нарушения.

Целый ряд ферментных препаратов используют в хирургической практике для очистки раневой поверхности от гноя, микробов, излишков грануляционной ткани; в клинике внутренних болезней их применяют:с целью разжижения вязких секретов, экссудатов, сгустков крови, например, при тяжелых воспалительных заболеваниях легких и бронхов. это в основном ферменты - гидролазы, способные расщеплять природные биополимеры - белки, НК, полисахариды. В связи с их противовоспалительным действием их применяют также при тромбофлебитах, воспалительно-дистрофических формах пар одонтоза , остеомиелите, гайморите, отитах и др. воспалительных заболеваниях.

Среди них такие ферменты, как трипсин, химотрипсин, РНК-за, ДНК -аза, фибринолизин. Фибиринолизин также используют для удаления внутрисосудистых тромбов. РНК-азу и ДНК-азу с успехом применяют для лечения некоторых вирусных инфекций, например для уничтожения вируса герпеса.

Такие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, лидаза, используются для борьбы с излишними рубцовыми образованиями.

Аспарагиназа - фермент, образуемый некоторыми штаммами кишечной палочки. Оказывает лечебный эффект при некоторых формах опухолей. Лечебный эффект связан со свойством фермента нарушать обмен аминокислоты аспарагина, необходимой опухолевым клеткам для роста.

Применение ферментных препаратов с лечебной целью представляет пока еще очень молодое направление медицинской науки. Ограничением здесь является трудоемкость технологий и дороговизна получения чистых ферментных препаратов в кристаллическом виде, пригодном для хранения и применения у человека. Кроме того, при использовании ферментных препаратов приходится учитывать также и другие обстоятельства:

1) Ферменты - это белки, а следовательно в некоторых случаях могут вызвать нежелательную аллергическую реакцию.

2) Быстрым разложением введенных ферментов (белковый препарат, поэтому немедленно захватывается клетками "мусорщиками" - макрофагами, фибробластами и др. Отсюда, требуются большие концентрации препаратов, чтобы достичь нужного эффекта.

3) Однако при повышении концентрации ферментные препараты могут оказаться токсичными.

И все-таки, в тех случаях, когда удается преодолеть эти препятствия, ферментные препараты оказывают прекрасный лечебный эффект.

Например, эти недостатки частично устраняются при переводе ферментов в так называемую "иммобилизованную" форму.

Более подробно о методах иммобилизации ферментов и способах их применения вы прочтете в ваших учебно-методических пособиях.

В основе многих патологических и предпатологических состояний организма лежат нарушения функционирования ферментных систем. Многие ферменты локализуются внутри клеток, а поэтому в сыворотке (плазме) крови их активность низка или вообще отсутствует. Именно поэтому анализируя внеклеточные жидкости (кровь), по активности определенных ферментов можно выявить изменения, происходящие внутри клеток различных органов и тканей организма. другие ферменты постоянно содержатся в крови, в известных количествах и имеют определенную функцию (например, ферменты системы свертывания крови).

Активность ферментов в сыворотке крови отражает сбалансированность скорости синтеза ферментов внутри клеток и выхода их из клеток. Увеличение активности ферментов крови может быть результатом ускорения процессов синтеза, понижения скорости выведения, повышения проницаемости клеточных мембран, действия активаторов, некроза клеток. Уменьшение активности ферментов вызывается повышением скорости выведения фермента, действием ингибиторов, угнетением синтеза.

Повышение активности в крови того или иного фермента является весьма ранним диагностическим тестом. Дополнительное определение изоферментного спектра позволяет уточнить локализацию патологического процесса, так как каждый орган имеет свой определенный изоферментный спектр.

В клинической биохимии большое значение имеет показатель активности аспарататаминотраисферазы и аланинаминотрансферазы. Эти трансаминазы содержатся в митохондриях и в растворимой фракции цитоплазмы клеток. Роль трансаминаз сводится к передаче аминогрупп аминокислот на кетокислоту. Коферментом трансаминаз служит пиридоксальфосфат, производное витамина В6. В крови животных активность обоих ферментов очень мала, по сравнению с их активностью в других тканях. Однако при патологиях, сопровождающихся деструкцией клеток, трансаминазы выходят через мембраны клеток в кровь, где их активность значительно увеличивается по сравнению с нормой. Несмотря на отсутствие строгой органной специфичности этих ферментов, повышение их активности наблюдают при гепатитах, мышечных дистрофиях, травмах, при чрезмерных физических нагрузках на организм, в частности, у спортивных лошадей.

Лактатдегидрогеназа(ЛдГ), гликолитический фермент, катализирующий обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную. ЛдГ состоит из четырех субъединиц и включает пять изоферментов. Причем в мышечной ткани преобладает изофермент ЛдГ5, в сердечной мышце ЛдГ1 и ЛдГ2. При остром инфаркте миокарда у больных в сыворотке крови повышается активность изоферментов ЛДГ1 и ЛдГ2. При паренхиматозном гепатите в сыворотке крови значительно возрастает активность изоферментов ЛдГ4 и ЛдГ5, тогда как активность ЛдГ1 и ЛдГ2 снижается.Активность ЛдГ в цельной крови существенно выше активности фермента в плазме крови. Поэтому даже минимальный гемолиз крови значительно изменяет активность фермента в плазме, что следует учитывать в лабораторной работе.

Креатинфосфокиназа(КФК), важную роль играет в энергетическом обмене. Креатинфосфокиназа необходима для ресинтеза АТФ за счет трансфосфорилирования АдФ с креатинфосфатом. Креатинфосфат относится к богатым энергией фосфатным соединениям,которые обеспечивают сокращение мышечного волокна, его расслабление, транспорт метаболитов в мышечную ткань.

Креатин-Ф + АдФ КФК > Креатин + АТФ.

Креатинфосфокиназа состоит из двух субъединиц - М и В, образующих три изофермента: ММ (мышечныий тип), МВ (сердечный тип), ВВ (мозговой тип).

Анализ тканей свидетельствует, что значительная активность КФК имеет место в скелетной мышце,миокарде, мозге. Сердечная мьшца содержит в основном изофермент ММ и МВ.Повышение активности изофермента МВ в сыворотке крови пациента свидетельствует о поражении сердечной мышцы. Определение изоферментов КФК является лучшим методом диагностики при наследственной мышечной дистрофии у цыплят, при недостатке селена у крупного рогатого скота, при паралитической миоглобинурии у лошадей.

Щелочная фосфатаза (ЩФ), - гидролитический фермент, синтезируемый в основном в печени выделяется из организма в составе желчи. Его оптимум активности находится при рН = 8-9. Это неспецифический фермент, катализирующий гидролиз многих фосфорных эфиров и присутствующий в плазме в форме изоферментов. Основной источник щелочной фосфатазы у молодых растущих животных - костная ткань. Активность щелочной фосфатазы значительно повышается при болезнях печени и костей, в частности, при остеомаляциях. Основная роль щелочной фосфатазы, вероятно, связана с отложением фосфатов кальция в костной ткани. Установлено повышение активности щелочной фосфатазы сыворотки крови при новообразованиях кости.

Холинэстераза - фермент, участвующий в процессе передачи нервного импульса, гидролизу ацетилхолин на ацетат и холин. Холинэстераза сыворотки крови включает два вида холинэстераз организма, основной субстрат которых - ацетилхолин. Ацетилхолинэстераза (АХЭ), гидролизирующая ацетилхолин в синапсах, называется истинной. Она присутствует в печени, эритроцитах и лишь малое ее количество локализовано в плазме. Холинэстераза плазмы крови является псевдохолинэстеразой, она гидролизует бутирилхолин в 4 раза быстрее, чем ацетилхолин. Этот фермент находится также в печени, поджелудочной железе, слизистой оболочке кишечника. Синтез АХЭ сыворотки крови происходит в печени, а поэтому при патологии этого органа наблюдается снижение активности фермента.

Необратимыми ингибиторами АХЭ являются токсические фосфорорганические соединения (ФОС). Так,ФОС инсектициды (хлорофос, фосфамид, карбофос, октаметил) избирательно связывают активные центры молекулы АХЭ и тем самым блокируют ее активность. Вследствие высокой липотропности ФОС способны проникать в организм животного через неповрежденную кожу и слизистые оболочки. При отравлении ФОС отмечают беспокойство животного, чувство страха, возбуждение, судороги, которые развиваются на фоне приступов удушья и кашля из-за спазма бронхов. Характерными при этом являются изменения со стороны глаз: резко суживается зрачок, начинается слезотечение, нарушается аккомодация. Чаще всего непосредственной причиной гибели животного, отравленного ФОС является паралич дыхательного центра.

Амилаза продуцируется слюнными железами и в больших количествах поджелудочной железой. Амилаза обладает специфическим действием на с-1,4-глюкозидные связи полисахаридов. Повышение активности амилазы сыворотки крови свидетельствует о развитии острого панкреатита. Умеренное повышение активности фермента отмечается при воспалении слюнных желез.